日逼免费视频,被操站,无码帝国中文字幕,免费AAA欧美

文章來源：中華骨科雜志, 2017,37(06) : 353-359|||作者：梁偉 呂天成 李理 李兵 

摘要  

目的

探討降鈣素相關(guān)基因肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨分化能力及其血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells，VECs）增殖的影響，及其促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合的細(xì)胞分子學(xué)作用機(jī)制。

方法

取3月齡SD大鼠10只，予雙側(cè)卵巢切除術(shù)制作骨質(zhì)疏松模型，術(shù)后6個(gè)月予顯微CT（Micro-CT）行骨密度檢測，確定建模成功；后采用全血貼壁法分離骨質(zhì)疏松性大鼠的BMSCs及VECs；在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度（1×10-7~1×10-10 mol/L）的CGRP，采用細(xì)胞增殖檢測（CCK-8）法檢測細(xì)胞增殖能力；CGRP對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs成骨分化能力的影響：通過堿性磷酸酶活性檢測及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、骨黏連蛋白、RunX2蛋白等成骨相關(guān)細(xì)胞基因mRNA的表達(dá)。CGRP對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠VECs血管化的影響：采用ELISA、RT-PCR法分別檢測細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular cell endothelial growth factor，VEGF）的蛋白分泌和基因表達(dá)水平。

結(jié)果

成功分離培養(yǎng)出骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs；CCK-8法測定細(xì)胞增殖能力，CGRP對(duì)BMSCs細(xì)胞的影響：CGRP各濃度組較對(duì)照組均增加，且呈劑量依賴關(guān)系，7 d時(shí)對(duì)照組OD值為0.58±0.02，CGRP組中10-7~10-10 mol/L分別為0.80±0.03，0.79±0.03，0.74±0.03，0.69±0.03，與對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CGRP對(duì)VECs細(xì)胞的影響：對(duì)照組OD值為2.20±0.01，CGRP組中10-7~10-10 mol/L分別為4.12±0.04，3.90±0.02，3.56±0.04，3.12±0.04，與對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。堿性磷酸酶活性檢測及RT-PCR方法檢測堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、骨黏連蛋白、RunX2蛋白等成骨相關(guān)細(xì)胞基因mRNA的表達(dá)，對(duì)照組與CGRP應(yīng)用的各濃度組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)論

10-7~10-10 mol/L的CGRP可以促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs及VECs增殖，且呈濃度依賴性，并能促進(jìn)BMSCs的成骨分化、細(xì)胞VEGF基因表達(dá)及蛋白的分泌、血管生成。

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的骨科代謝性疾病，由骨質(zhì)疏松引發(fā)的骨折發(fā)病率逐年增高。骨質(zhì)疏松性骨折多發(fā)生于老年人，屬于病理性骨折，因骨質(zhì)量差，骨折初始固定不牢固、穩(wěn)定性差、骨折愈合過程緩慢、恢復(fù)時(shí)間長，易發(fā)生骨折延遲愈合甚至不愈合等系列問題，針對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折原因及愈合的相關(guān)研究已成為熱點(diǎn)[1]。成骨細(xì)胞的增殖及分化和骨折局部血管化是促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合的關(guān)鍵因素，而骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）在特異因子誘導(dǎo)下，具有向多種細(xì)胞系分化的潛能，可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、胰島β細(xì)胞等。如BMSCs成脂分化能力增強(qiáng)而成骨分化能力降低，可致骨質(zhì)疏松，表現(xiàn)為骨量減少與髓腔內(nèi)的脂肪增多[2]。如何使BMSCs成骨分化能力增強(qiáng)，成為骨質(zhì)疏松性骨折的研究方向。

近年來，神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)骨組織代謝的作用的相關(guān)研究受到越來越多的重視，神經(jīng)纖維末梢可以通過釋放多種神經(jīng)遞質(zhì)分子如鈣素相關(guān)基因肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）、神經(jīng)肽、P物質(zhì)等發(fā)揮作用。在骨組織周圍分布著大量CGRP陽性神經(jīng)纖維，這些神經(jīng)纖維可分泌CGRP調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，并增加骨折局部供血。CGRP表達(dá)強(qiáng)度提高，有利于刺激骨折愈合過程中各種細(xì)胞的遷移、增殖及分化，形成大量的骨性骨痂和軟骨痂[4]。另外，CGRP參與調(diào)節(jié)骨折局部的多種細(xì)胞功能，對(duì)骨折愈合過程中骨痂的血管生成也有促進(jìn)作用，可刺激骨折微環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells，VECs）增殖，加速血管生成，增加局部血流；同時(shí)促進(jìn)骨折愈合過程中BMSCs增殖，刺激細(xì)胞內(nèi)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，增加堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的活性，促進(jìn)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化及礦化，刺激骨痂的生長[3,4]。但CGRP能否加速骨質(zhì)疏松骨折的病理環(huán)境下的血管化，并促進(jìn)BMSCs增殖及分化仍然需要進(jìn)一步研究。

本研究使用卵巢切除法制造骨質(zhì)疏松大鼠模型，提取BMSCs及VECs，在體外與不同濃度CGRP共培養(yǎng)，觀察CGRP對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs及VECs細(xì)胞的影響，目的在于：①明確CGRP是否可對(duì)病理性BMSCs的增殖及成骨分化及VECs的成血管化起到促進(jìn)作用；②初步探討CGRP促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合的細(xì)胞分子作用機(jī)制。

材料與方法

一、建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型

取10只3月齡雌性SD大鼠（廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重220~260 g，隨機(jī)分為兩組：雙側(cè)卵巢切除術(shù)組（ovariectomy組，ovx組）5只，采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)建立骨質(zhì)疏松模型；假手術(shù)組（sham operation組，sham組）5只，僅切除少許脂肪組織。

術(shù)后6個(gè)月行顯微CT（Micro-CT）掃描檢測股骨相對(duì)骨體積（bone volume/tissue volume，BV/TV）和骨密度（bone mineral density，BMD）確認(rèn)骨質(zhì)疏松模型是否建立成功。

二、材料和試劑

本研究中采用α-杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)液（α-DMEN，#11320-033，Gibco公司，美國），胎牛血清（FBS，#16000-044，Gibco公司，美國），DMEM/F12培養(yǎng)液（# 11330057，Gibco公司，美國），細(xì)胞培養(yǎng)板（Coming公司，美國），CCK-8（#PA5-32348，Life technologies公司，美國），ALP染色試劑盒（#AP0100-1KT，Sigma公司，美國），TRIzol試劑盒(#15596-066，Invitrogen公司，美國），CGRP(#C2806，Sigma公司，美國），VEGF ELISA試劑盒（#ERVEGFACL，Gibco公司，美國）。

三、分離提取BMSCs

取骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，分離雙側(cè)股骨及脛骨，去除周圍軟組織，兩端開槽后用α-DMEN培養(yǎng)液沖洗骨髓腔數(shù)次，1 600 r/min離心6 min后棄上清，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的α-DMEN培養(yǎng)基（含1%青霉素和鏈霉素）重懸細(xì)胞，接種于25 cm培養(yǎng)瓶內(nèi)，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下孵育，隔天換液體積分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶消化傳代至第三代為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。

四、VECs的分離與培養(yǎng)

取骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，無菌條件下開胸取出胸主動(dòng)脈及周圍軟組織，暴露主動(dòng)脈內(nèi)膜，結(jié)扎動(dòng)脈兩端后用燒熱的鑷子燙烙，置于50 ml鋪有鼠尾膠培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，采用含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，6 d后換液并棄置主動(dòng)脈，觀察細(xì)胞鋪滿瓶底80%時(shí)候，體積分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化傳代。

五、CCK-8檢測細(xì)胞增殖

培養(yǎng)基稀釋BMSCs及VECs，并以1×104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h后換入不同濃度CGRP的培養(yǎng)液200 μl，設(shè)立不含CGRP培養(yǎng)液為對(duì)照組。采用CCK-8法在波長450 nm下檢測第1、3、5、7天的光密度值以了解細(xì)胞的增殖情況。每組重復(fù)5個(gè)樣本。

六、BMSCs的成骨分化

（一）ALP活性

將BMSCs以2×104/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h后換入單純培養(yǎng)液及含不同濃度CGRP的培養(yǎng)液。使用ALP試劑盒法檢測第1、3、7、14天的ALP活性表達(dá)。每組重復(fù)5個(gè)樣本。

（二）BMSCs成骨相關(guān)基因檢測

使用TRIzol試劑盒提取細(xì)胞的RNA，常規(guī)行反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)（RT-PCR）實(shí)驗(yàn)，檢測第1、3、7、14天細(xì)胞成骨基因的表達(dá)情況。

ALP引物：上游5’-CGTTGACTGTGGTTACTGCTGA-3’，下游5’-TTGTAACCAGGCCCGTTG-3’；BMP-2引物：上游5’-CGTGCTCAGCTTCCATCAC-3’，下游5’-CCTGCATTTGTTCCCGAAA-3’。

RunX2引物：上游5’-TTTGCAGTGGGACCGACA-3’，下游5’-AGCCATGGTGCCCGTTAG-3’。

Ⅰ型膠原蛋白引物：上游5’-TCTCCATGGCCTCTGCAA-3’，下游5’-CATGTGTGGCCGATGTTTC-3’。

骨黏連蛋白引物：上游5’-CTCCCATTGGCGAGTTTG-3’，下游為5’-TGTAGTCCAGGTGGAGCTTGTG-3’。

內(nèi)參選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物：上游5’-CACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，下游5’-GGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。每組測試5個(gè)平行樣本。

七、VECs的血管內(nèi)皮因子的分泌

（一）ELISA法檢測細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮因子水平

第三代VECs稀釋到2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液中，添加到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h后換入含不同濃度CGRP的培養(yǎng)液作為實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)第1、2、3天后分別收集上清液，采用ELISA檢測試劑盒方法進(jìn)行檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular cell endothelial growth factor，VEGF）水平。每組設(shè)5個(gè)平行樣本，比較各組細(xì)胞分泌VEGF水平。

（二）PCR法檢測VECs中VEGF的表達(dá)水平

骨質(zhì)疏松大鼠VECs在CGRP實(shí)驗(yàn)組及sham組中培養(yǎng)1、2、3 d后，用TRIzol法收集各組細(xì)胞的RNA，用光譜儀檢測其純度和濃度。

設(shè)計(jì)合成RNA引物：VEGF引物：上游5’-ACTCGCCCTCATCCTCTTCC-3’，下游5’-TCAACACACTCACACACACAAC-3’；內(nèi)參選用β-Actin引物：上游5’-TGGCACCCAGCACAATGAA -3’，下游5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAA GCA-3’。

使用TRIzol法進(jìn)行總RNA抽提，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR反應(yīng)條件優(yōu)化，隨后采用SYBR GreenⅠ染料法進(jìn)行RT-PCR檢測，按照試劑盒說明書配好反應(yīng)體系，上機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行融解曲線繪制。每組測試5個(gè)平行樣本。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0（SPSS公司，美國）統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示，CGRP實(shí)驗(yàn)組（10-7~10-10 mol/L）與對(duì)照組的ELISA及PCR數(shù)據(jù)的比較采用Students’成組設(shè)計(jì)資料t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α值取雙側(cè)0.05。

結(jié)果

一、骨質(zhì)疏松大鼠模型

經(jīng)Micro-CT分析結(jié)果顯示術(shù)后6個(gè)月sham組BV/TV為17.1%±2.5%，ovx組為3.4%±0.9%，sham組較ovx組多13.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；sham組BMD為（0.343±0.030）g/cm2，ovx組（0.183±0.019）g/cm2，sham組較ovx組多0.12 g/cm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

細(xì)胞培養(yǎng)1 d后各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組之間無明顯差異，在第3、5、7天，CGRP各組細(xì)胞較對(duì)照組均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

7 d后對(duì)照組OD值0.58±0.02，CGRP組中10-7~10-10 mol/L各組分別為0.80±0.03，0.79±0.03，0.74±0.03，0.69±0.03，各組與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10-7mol/L組的BMSCs增值率為較對(duì)照組提高了約30%，在實(shí)驗(yàn)組各個(gè)濃度CGRP的組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，10-7 mol/L組增殖最快，這說明細(xì)胞增殖與CGRP的濃度在10-7~10-10 mol/L之間呈劑量依賴型（圖1A）。

圖1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果　A　CGRP對(duì)BMSCs細(xì)胞增殖的影響，采用CCK-8法檢測，不同濃度的CGRP（10-10~10-7mol/L）均可促進(jìn)細(xì)胞增殖，且呈濃度依賴性　B　CGRP對(duì)VECs細(xì)胞增殖的影響，不同濃度的CGRP均可促進(jìn)細(xì)胞增殖，且呈濃度依賴性

CGRP對(duì)VECs細(xì)胞增殖的影響檢測發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組OD值2.20±0.01，CGRP濃度10-7~10-10 mol/L各組分別為4.12±0.04，3.90±0.024，3.56±0.04，3.12±0.04，各組與對(duì)照組的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B）。

三、CGRP對(duì)BMSCs細(xì)胞成骨分化的影響

7 d后ALP對(duì)照組為1.000±0.205，CGRP濃度10-7 mol/L組為2.578±0.210，CGRP濃度10-10 mol/L組為2.351±0.201；BMP-2對(duì)照組為0.980±0.200，CGRP濃度10-7 mol/L組為3.428±0.255，CGRP濃度10-10 mol/L組為2.915±0.202；COLL-Ⅰ對(duì)照組為1.030±0.202，CGRP濃度10-7 mol/L組為2.519±0.240，CGRP濃度10-10 mol/L組為2.348±0.201；RunX2對(duì)照組為0.993±0.213，CGRP濃度10-7 mol/L組為2.499±0.262，CGRP濃度10-10 mol/L組為2.220±0.250；骨黏連蛋白對(duì)照組為1.020±0.200，CGRP濃度10-7 mol/L組為1.973±0.212，10-10 mol/L組為1.864±0.250，各組與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

14 d后ALP對(duì)照組為0.005±0.000，CGRP濃度10-7~10-10 mol/L組分別為0.044±0.002，0.042±0.003，0.039±0.001，0.025±0.001，各組與對(duì)照組比較的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

細(xì)胞ALP活性檢測結(jié)果顯示：CGRP作用于細(xì)胞7、14 d，含不同濃度CGRP的實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組ALP活性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，7 d時(shí)10-7 mol/L組的堿性磷酸酶活性較對(duì)照組提高了約一倍，提示CGRP早期可以促進(jìn)BMSCs成骨分化（圖2）。PCR基因檢測結(jié)果顯示CGRP能增加成骨分化的早期ALP和COLL-Ⅰ基因的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)成骨分化晚期BMP-2，骨黏連蛋白和RunX2基因的表達(dá)（圖3）。

圖2 CGRP對(duì)BMSCs細(xì)胞分泌ALP活性檢測，隨時(shí)間增加，不同濃度CGRP（10-10~10-7 mol/L）均可促進(jìn)細(xì)胞分泌ALP，且呈濃度依賴性

圖3 成骨相關(guān)基因的PCR檢測結(jié)果　A　隨著時(shí)間推移，CGRP上調(diào)ALP的表達(dá)，且10-10 mol/L組的表達(dá)水平高于10-7 mol/L組　B　隨著時(shí)間推移，CGRP上調(diào)BMP-2的表達(dá)，且10-10 mol/L組的表達(dá)水平高于10-7 mol/L組　C　隨著時(shí)間推移，CGRP上調(diào)COLL-Ⅰ的表達(dá)，且CGRP濃度10-10 mol/L組的表達(dá)水平高于10-7mol/L組　D　隨著時(shí)間推移，CGRP上調(diào)骨黏連蛋白的表達(dá)，且10-10 mol/L組的表達(dá)水平高于10-7 mol/L組　E　隨著時(shí)間推移，CGRP上調(diào)RunX2的表達(dá)，且10-10 mol/L組的表達(dá)水平高于10-7 mol/L組

四、CGRP對(duì)VECs的VEGF的分泌的影響

采用VEGF-ELISA試劑盒檢測細(xì)胞受CGRP刺激培養(yǎng)1、3、5、7 d后培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌VEGF水平，7 d后對(duì)照組VEGF濃度為3.218±0.314，CGRP濃度10-7~10-10 mol/L分別為5.579±0.564，4.792±0.159，4.721±0.358，4.675±0.112，各組與對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。含不同濃度CGRP的實(shí)驗(yàn)組的VEGF水平均明顯高于對(duì)照組，由此說明釋放CGRP促進(jìn)VECs分泌VEGF（圖4）。

圖4 CGRP對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF的結(jié)果，通過ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的增加，不同濃度的CGRP（10-10~10-7mol/L）均可刺激細(xì)胞分泌VEGF，且呈濃度依賴性

PCR檢測細(xì)胞中VEGF基因表達(dá)水平：7 d后對(duì)照組VEGF濃度0.999±0.008，CGRP濃度10-7 mol/L為4.433±0.182，10-10 mol/L為4.121±0.195，各組與對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各時(shí)間點(diǎn)CGRP實(shí)驗(yàn)組VEGF-mRNA的表達(dá)水平均較對(duì)照組增高，結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果相同。無論是VEGF基因表達(dá)水平，還是蛋白分泌水平，CGRP實(shí)驗(yàn)組均明顯高于對(duì)照組（圖4，圖5）。

圖5 VEGF mRNA的表達(dá)，通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)CGRP可上調(diào)細(xì)胞中VEGF mRNA的表達(dá)，且10-7 mol/L的表達(dá)量最高

討論

一、骨質(zhì)疏松性骨折的特點(diǎn)

骨組織是一種復(fù)雜的動(dòng)態(tài)組織，在其不斷的新陳代謝過程中，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞是最關(guān)鍵的兩種細(xì)胞，它們的共同作用調(diào)節(jié)骨組織代謝。骨組織周圍還伴行著大量的血管及神經(jīng)。因此，骨組織的修復(fù)過程，其實(shí)是神經(jīng)對(duì)骨組織的調(diào)控下及血管對(duì)骨組織的能量供應(yīng)的前提下，機(jī)體各類細(xì)胞之間錯(cuò)綜復(fù)雜的作用。由此可見，血液的供應(yīng)和神經(jīng)支配的重建是促進(jìn)骨折愈合、保持骨折局部修復(fù)區(qū)域內(nèi)環(huán)境的生物學(xué)穩(wěn)定性關(guān)鍵因素之一。而由骨質(zhì)疏松癥造成的骨折、骨不愈合等一直是威脅人類生命健康的醫(yī)學(xué)難題。骨質(zhì)疏松骨微環(huán)境下，成骨細(xì)胞的功能減弱，而過渡活躍的破骨細(xì)胞抑制了成骨細(xì)胞的活力。同時(shí)，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成脂分化能力增強(qiáng)而成骨分化能力減弱，最終導(dǎo)致骨形成減少。

二、CGRP對(duì)骨折愈合的作用

CGRP代表一類具有多功能的神經(jīng)肽，其由37個(gè)氨基酸組成的多肽，并由上級(jí)神經(jīng)調(diào)控，在脊髓后根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)合成，通過軸漿運(yùn)輸?shù)姆绞降竭_(dá)感覺神經(jīng)纖維的末梢，以分泌顆粒的形式儲(chǔ)存在胞漿中，隨著神經(jīng)末梢分布于周圍器官[5,6]。在血管內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等這些與骨組織代謝直接相關(guān)的細(xì)胞表面均存在CGRP受體[7]。CGRP能與這些細(xì)胞表面的CGRP受體特異性的結(jié)合，發(fā)揮作用。在骨折局部環(huán)境中新生成的骨組織及骨膜組織上CGRP的陽性纖維大量增加，導(dǎo)致血漿CGRP濃度明顯增加[8,9]。神經(jīng)系統(tǒng)可通過分泌CGRP來參與調(diào)節(jié)骨折局部的細(xì)胞功能，包括增加骨折局部供血；促進(jìn)BMSCs及成骨細(xì)胞增殖及分化來增強(qiáng)骨修復(fù)效果[10,11,12,13,14]。

三、CGRP對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折愈合的作用

目前研究CGRP對(duì)骨組織的影響大多是基于健康細(xì)胞株，對(duì)于骨質(zhì)疏松性環(huán)境下的研究甚少。本研究成功分離提取骨質(zhì)疏松大鼠的BMSCs及VECs，體外用CGRP刺激細(xì)胞，從細(xì)胞的增殖，細(xì)胞外基質(zhì)的改變及細(xì)胞內(nèi)基因的變化來分析其對(duì)細(xì)胞的作用。CGRP早期能促進(jìn)BMSCs的增殖，后期能刺激BMSCs分泌ALP，促使細(xì)胞向成骨分化。因此，考慮CGRP對(duì)BMSCs細(xì)胞成骨分化過程中的各個(gè)階段均有作用。CGRP促進(jìn)BMSCs細(xì)胞的增殖，以產(chǎn)生足夠多的前體細(xì)胞，然后其在后期逐漸刺激細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。然而CGRP在細(xì)胞成骨分化過程中的作用機(jī)制仍然不是很清楚。本研究從細(xì)胞內(nèi)基因的層面，探討CGRP對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制。目前已有許多研究者對(duì)BMSCs的成骨分化過程中的相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行研究[7]，發(fā)現(xiàn)ALP、COLL-Ⅰ、骨鈣素、骨黏連蛋白、BMP等為較關(guān)鍵的基因。本研究中，使用RT-PCR檢測CGRP誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)BMP-2、RunX2、COLL-Ⅰ、ALP及骨黏連蛋白的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CGRP可刺激細(xì)胞上述基因及蛋白的表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，CGRP可激活細(xì)胞內(nèi)BMP-2信號(hào)通路途徑，上調(diào)RUNX2基因的表達(dá)，RunX2隨后啟動(dòng)成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，如ALP、COLL-2等，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)逐漸成熟使BMSCs向成骨細(xì)胞分化。而CGRP也能刺激細(xì)胞內(nèi)VEGF基因的表達(dá)，提高細(xì)胞分泌VEGF，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，形成新生血管。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)出骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs及VECs，并證實(shí)CGRP能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成，改善骨組織中的神經(jīng)血管微環(huán)境，并提高病理性BMSCs增殖的同時(shí)促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化，為血供環(huán)境差及成骨能力弱的骨質(zhì)疏性骨損傷的治療提供一定的理論基礎(chǔ)，將CGRP應(yīng)用于骨折修復(fù)可能是骨組織工程治療骨質(zhì)疏松性骨折一個(gè)新的方向。但骨折愈合涉及多種因素，CGRP應(yīng)用于臨床治療前還需做更多、更深入的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證其可行性及安全性。